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溫度控制對PCR儀的重要性

更新時間:2018-03-12點擊次數:3125
         對普通PCR儀來說,溫度控制主要是指溫度的準確性、均勻性、以及升降溫速度,對梯度PCR儀來說,除了溫度的準確性和均勻性、升降溫速度以外,還必須考慮儀器在梯度模式和標準模式下是否具有同樣的溫度特性。 
        溫度的準確性是指樣品孔溫度與設定溫度的一致性,它直接關系到實驗的成敗。如果排除樣品加入過程中的問題,對于PCR反應而言zui重要的莫過于溫度控制的準確性,由于PCR是一個幾何級數擴增的過程,擴增過程中退火溫度的細微變化會被放大而直接影響結果,不論是變性、退火還是延伸都需要準確控制溫度,對退火溫度而言溫控顯的尤為重要,有時1度甚至0.5度的差異也能決定實驗的成功與失敗,所謂差之毫厘,謬之千里。因而對PCR擴增儀而言溫度控制就意味著質量。 
        溫度的均勻性是指樣品孔間的溫度差異,它關系到在不同樣品孔進行反應結果的一致性。我們在實驗中發(fā)現有時用同樣的樣品,同樣的PCR反應程序,zui后的結果竟然差異非常明顯,或許就是因為不同位置的溫度不均一性所致。一些使用過早期PCR儀的腦子格外靈光的研究人員偏愛使用PCR儀中間某幾個固定的孔,就是因為過往反復的教訓和認真的思索得出了這樣的結論,PCR儀的溫度均勻性不好,特別是zui外周的樣品孔情況更差,很有可能影響實驗結果-即“位置的邊緣效應”會影響結果的可重復性。正是這種位置效應對定量PCR的結果的影響更為明顯。
        溫度控制除了度,還有一個廠家喜歡大力宣傳的指針-升降溫的速度。更快的升降溫速度,可以縮短反應進行的時間,而且縮短了可能的非特異性結合、反應的時間,能提高PCR反應特異性。因此從本質而言溫控方式就從以前相對穩(wěn)定耐用的機械式轉向了升降溫更快速的半導體。除了機械本身的原因,影響升降溫速度的還有制作承托樣品管的基座模塊的材料的導熱性。
        作為用戶來說,當然更愿意選擇升降溫速度快的,這就像汽車上好看的表面配置一樣容易看到,而內在的穩(wěn)定性和耐用性往往是看不到的而容易被忽略。必須注意到,儀器的升降溫速度和樣品管中的樣品的升降溫速度并非同一回事,因為樣品管與基座接觸的緊密性、導熱性、鄰近樣品管的相互影響都會影響樣品的實際升降溫速度。現在的PCR儀一般具有兩種溫控模式,即模塊溫控模式(Block-control)和反應管溫控模式(tube-control)。在模塊溫控模式下,機器根據探測器直接探測的溫控模塊(即承載樣品的金屬臺)的溫度進行控制,這種模式適用于長時間的靜態(tài)孵育(如連接、 切、去磷酸化等)。反應管溫控模式實際上是一種仿真試管/PCR板的溫控模式,根據探測器所探測到的溫控模塊的溫度由計算器計算出管內/PCR板孔內樣品液的溫度來進行控制。一般說來,管溫控更為準確,因為管內樣品的溫度無法與溫控模塊同時達到預設溫度。特別是PCR反應中的孵育過程一般都很短暫(30秒或更短),如果采用只有模塊溫控模式的話,反應混合物孵育的時間與程序設定的時間會有相當大的差距。而反應管控制的算法能自動補償時間,而且適合各種類型的反應管,確保反應混俁物按照程序設定的時間維持預設溫度。
        梯度PCR:對于一個PCR反應,雖然有各種各樣的PCR引物設計軟件或者經驗公式計算zui適的退火溫度,可是由于模版中堿基的組合千變萬化,對于特殊片斷,經驗公式得到的數據不一定能"P"出來結果,細微的變化對結果都可能產生決定性的影響,因而“摸條件”一度是讓人很頭疼的問題。梯度PCR的出現部分解決了一些問題-在反應過程中每個孔的溫度控制條件可以在范圍內按照梯度變化,根據結果,一步就可以摸索出的反應條件。不單退火溫度,連變性溫度和延伸溫度都可以優(yōu)化-對于多種聚合酶混合擴增來說這個非常重要,因為Taq和校正酶的*反應溫度可能有顯著差異,優(yōu)化延伸溫度就顯得很重要。
        對于帶梯度功能的PCR儀,需要考慮梯度模式下不同梯度管排間的溫度均勻性和準確性,還必須考慮儀器在梯度模式和標準模式下是否具有同樣的溫度特性。這種差異可能導致在梯度模式下得出的*條件與標準模式下單獨做的結果出現差異。
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